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疫苗
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DNA 疫苗

基于核酸的診斷、預(yù)后和治療平臺(tái)是很有前途的工具,由于其獨(dú)特的特性,如熱穩(wěn)定性、抗變性和簡(jiǎn)單存儲(chǔ),它們正在取代舊的基于蛋白質(zhì)的平臺(tái)。一個(gè)好的疫苗平臺(tái)應(yīng)該是快速的、簡(jiǎn)單開(kāi)發(fā)的、可再現(xiàn)的、熱穩(wěn)定的,并且可在降低開(kāi)發(fā)成本和風(fēng)險(xiǎn)的情況下制造。 DNA 平臺(tái)解決了其中的許多目標(biāo)。

 

DNA 疫苗是 DNA 載體,例如細(xì)菌質(zhì)粒、小環(huán) DNA 或線性、共價(jià)閉合的簡(jiǎn)約表達(dá)構(gòu)建體,它們包含至少一個(gè)編碼目標(biāo)抗原的真核表達(dá)盒。表達(dá)盒通常由真核啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、抗原基因和 poly(A) 信號(hào)序列組成,它們對(duì)于抗原在真核細(xì)胞(例如肌肉細(xì)胞)中的表達(dá)至關(guān)重要。 DNA 疫苗在臨床前研究中顯示出令人信服的安全性和免疫原性。幾種 DNA 疫苗目前已獲準(zhǔn)用于大型動(dòng)物(如馬)和小型動(dòng)物(如雞)的獸醫(yī)使用。而印度基于ZyCoV-D 3 期試驗(yàn)的安全性、免疫原性和有效性結(jié)果,授予其緊急使用授權(quán),這也是 DNA 疫苗的里程碑式進(jìn)展。西尼羅河病毒 (WNV)、埃博拉病毒和馬爾堡病毒以及 SARS-CoV-2 的 DNA 疫苗臨床試驗(yàn)結(jié)果表明,抗體在免疫幾周后在人體中產(chǎn)生。但在臨床試驗(yàn)中也有很多免疫原性差的情況。目標(biāo)抗原和構(gòu)建、制劑和遞送方法的優(yōu)化似乎是 DNA 疫苗免疫原性的關(guān)鍵因素。

 

在過(guò)去幾年中,DNA 疫苗領(lǐng)域取得了許多進(jìn)展。 DNA 構(gòu)建、遞送和給藥途徑的進(jìn)步以及分子佐劑的使用增強(qiáng)了 DNA 疫苗的免疫原性。 DNA 免疫有望徹底改變疫苗領(lǐng)域。 DNA 疫苗的制造和儲(chǔ)存成本較低,使其成為全球疫苗接種的理想候選疫苗,即使在低收入國(guó)家也是如此。

 

質(zhì)粒 DNA 是通過(guò)轉(zhuǎn)基因細(xì)菌產(chǎn)生的,通常是大腸桿菌(E.Coli)。在臨床前和臨床規(guī)模下,遵循良好生產(chǎn)規(guī)范 (GMP) 生產(chǎn)質(zhì)粒 DNA 需要仔細(xì)開(kāi)發(fā)最佳和經(jīng)濟(jì)的商業(yè)工藝。細(xì)菌細(xì)胞在發(fā)酵條件下生長(zhǎng),通常在由化學(xué)成分確定的物質(zhì),如葡萄糖或甘油作為碳源、鹽、維生素等組成的成分確定的或基本的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。發(fā)酵后,通過(guò)離心或微濾收集細(xì)菌細(xì)胞。然后采用化學(xué)、物理或機(jī)械方法進(jìn)行細(xì)胞裂解。細(xì)胞裂解產(chǎn)生的裂解液含有細(xì)胞碎片、質(zhì)粒 DNA 和可溶性雜質(zhì)。切向流過(guò)濾等澄清技術(shù)用于從裂解液中去除固體。然后,采用污染物沉淀、質(zhì)粒沉淀、層析純化(陰離子交換層析,然后是疏水相互作用層析,有時(shí)是尺寸排阻層析)等幾個(gè)純化步驟來(lái)去除污染物(例如宿主蛋白、內(nèi)毒素、RNA、基因組 DNA 和質(zhì)粒 DNA 的線性和開(kāi)環(huán)形式)。純化的質(zhì)粒 DNA 與賦形劑和佐劑一起配制,并通過(guò)除菌過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。

 

小環(huán) DNA 是通過(guò)在E.COli中誘導(dǎo)親本質(zhì)粒的分子內(nèi)重組而產(chǎn)生的。例如,重組酶,如φC31整合酶,和限制酶(RE),如I-SceI,的表達(dá)由阿拉伯糖誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)。重組酶介導(dǎo)其識(shí)別序列之間的位點(diǎn)特異性重組,產(chǎn)生兩個(gè)不同的環(huán)狀 DNA 分子(i)含有真核表達(dá)盒的小環(huán) DNA 和(ii)由細(xì)菌骨架組成的迷你質(zhì)粒(MP),MP 可被誘導(dǎo)的 RE 特異性降解。然后可以提取、純化和制劑小環(huán) DNA,類(lèi)似于用于 DNA 質(zhì)粒的方法。


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