慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，粒徑為80-120nm，由單鏈RNA序列組成，其轉(zhuǎn)錄成DNA并可整合到宿主基因組中，導(dǎo)致持續(xù)感染。大多數(shù)慢病毒載體源于HIV-1，并保留整合至感染細(xì)胞基因組的能力。LV由于能夠更有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)非增殖或緩慢增殖的細(xì)胞，在臨床應(yīng)用中非常流行。近來，多個使用臨床試驗使用第三代自滅活LV將基因?qū)朐煅杉?xì)胞，以治療原發(fā)性免疫缺陷或血紅蛋白病[2]。LV最常見的應(yīng)用是通過嵌合抗原受體（CAR）或克隆的T細(xì)胞受體遞送引入基因，以產(chǎn)生對抗腫瘤的免疫。

對于慢病毒的上游生產(chǎn)，盡管已經(jīng)有研究證明制備穩(wěn)定的慢病毒載體包裝/生產(chǎn)細(xì)胞系是可行的，其有潛力提高批次間的一致性，保證供應(yīng)并降低成本[6]，因其可簡化LV生產(chǎn)的操作和供應(yīng)鏈，但往往需要較長的細(xì)胞系開發(fā)構(gòu)建時間，所以基于HEK293T細(xì)胞以質(zhì)粒DNA瞬時轉(zhuǎn)染的策略仍是慢病毒載體大規(guī)模生產(chǎn)的主要選擇。對于細(xì)胞培養(yǎng)，在開發(fā)階段，鑒于僅需要較小的批次體積，以及HEK293T細(xì)胞的貼壁特性和耗材的簡單可獲得性，以貼壁培養(yǎng)為主導(dǎo)。但隨著規(guī)模放大，需要更高且更一致的批次規(guī)模，生產(chǎn)需轉(zhuǎn)移至在搖擺式生物反應(yīng)器或攪拌罐生物反應(yīng)器中進(jìn)行的懸浮培養(yǎng)，而培養(yǎng)基和添加物的選擇直接與生產(chǎn)細(xì)胞的擴(kuò)增和活性以及下游工藝的成功有關(guān)，因培養(yǎng)基可影響載體的穩(wěn)定性并組成進(jìn)入下游的進(jìn)樣料液，需仔細(xì)優(yōu)化。

相比AV或AAV，LV下游工藝的更大挑戰(zhàn)在于其為囊膜病毒，固有的復(fù)雜性和敏感性需要快速的工藝處理，比如其對凍融循環(huán)、鹽、pH、剪切以及緩沖液滲透壓更為敏感，且顆粒熱穩(wěn)定性較低，37℃下半衰期為7-8 hr[7]。LV的下游工藝也可分為3個主要階段，包括收獲和澄清；中間體純化，其中包括1個或多個濃縮和純化步驟；精純、制劑以及選擇性進(jìn)行的除菌過濾。

LV是細(xì)胞外產(chǎn)物，由生產(chǎn)細(xì)胞釋放到培養(yǎng)液中，所以，收獲液質(zhì)量高度取決于細(xì)胞活性，其決定了宿主細(xì)胞源性雜質(zhì)的含量。澄清旨在去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，深層過濾是該步驟一個簡單且經(jīng)濟(jì)的選擇，經(jīng)優(yōu)化后，可達(dá)到接近100%的收率。為提高最終產(chǎn)品的整體生物安全性，并符合法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，通常需要核酸酶處理，以消解核酸，這也有利于降低料液粘度，方便后續(xù)步驟操作，其通常在澄清步驟后進(jìn)行，但也有報導(dǎo)在更為后續(xù)的階段體積進(jìn)一步降低后進(jìn)行。

層析是純化方案的關(guān)鍵技術(shù)，旨在去除蛋白質(zhì)、核酸、低分子量雜質(zhì)以及脂質(zhì)等，以結(jié)合-洗脫模式操作的陰離子交換層析和以流穿模式操作的復(fù)合模式層析已被報道單獨或結(jié)合用于LV的純化，但如前所述，由于LV對鹽和pH等條件敏感，需仔細(xì)優(yōu)化層析緩沖液條件。此外也有報道使用固定金屬親和層析和體積排阻層析，但通常限于較小的規(guī)模。TFF是快速且穩(wěn)健的料液濃縮和換液技術(shù)，對于LV，可選擇MWCO 750kD的中空纖維過濾器。藥物底物灌裝前的除菌過濾可使用0.22μm過濾器，但考慮LV較大的粒徑，報道該步驟損失可達(dá)到30-50%，一種降低損失的策略是在最終TFF步驟之前進(jìn)行除菌過濾，或者使用封閉系統(tǒng)實現(xiàn)無菌工藝而跳過該步驟。